DNA’nın izolasyonunda çeşitli yöntemlerden yararlanılır. Genelde izole edilen kromozal veya plazmid DNA moleküllerinin saflığının kontrolü ve miktarının tayini spektral yöntemlerle yapılmaktadır.
SPEKTRAL YÖNTEMLER
Nükleotidlerin heterosiklik halkaları 260 nm. Dalga boyundaki ışığı max. emme özelliği taşıdığından, bu dalga boyundaki emme derecesi nükleik asitlerin miktarının bir ölçüsüdür. Buna göre DNA’nın miktar ve saflığı,spektrofotometrede 260 ve 280 nm. Dalga boylarında elde edilecek değerlerden belirlenebilir. 1 optik dansite (OD) çift iplikli DNA için 50 μg/ml. tek iplikli DNA veya RNA için 40 μg/ml. ve oligonükleotidler için ise 20 μg/ml’ye karşılık gelmektedir.
Örneğin, izole edilen DNA çift iplikli ise,miktarının belirlenmesi için aşağıdaki formülden yararlanılır.
DNA(μg/ml) = 260 nm.deki OD x sulandırım oranı x katsayı (50)
ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER
DNA moleküllerinin analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla beraber tüm laboratuvarlarda rutin olarak yararlanılan en basit yöntemlerden biri jel elektroforezidir. Yöntemin avantajları basit ve hızlı olması, ayrıca diğer yöntemlerle yeterli düzeyde ayrılamayan DNA fragmentlerinin ayrılmasını sağlamaktır.
DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı, molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.
Jel elektroforezinde kullanılan destekleyici madde (matriks) mekaniksel etkiyi engellemek ve molekülleri büyüklüklerine göre ayırmak için kullanılır. Matriks nişasta, poliakrilamid, agaroz veya agaroz akrilamid karışımı olabilir. Poliakrilamid jeller genellikle küçük DNA fragmentleri ve RNA moleküllerinin ayırımında kullanılır. Ancak poliakrilamid jelleri hazırlamak zordur ve uzun süre alır. Ayrıca uygulanacak DNA’nın yüksek konsantrasyonda olması olması gerektiğinden bu tip jellerin kullanılması pratik değildir. Bu nedenle rutin olarak en fazla kullanılan yöntem agaroz jel elektroforezidir.
AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ
Agaroz kırmızı bir alg türü olan Agar agar’dan izole edilen doğrusal bir polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür.
Ticari olarak üretilen agarozların saflık dereceleri farklı olabilmektedir. Bu durum DNA’nın göç hızını etkiler. Ayrıca kimyasal yapısı değiştirilerek düşük sıcaklıkta eriyebilen agaroz tipleride geliştirilmiştir. Bu agarozların ayırım gücü çok fazladır. DNA jelden geri kazanılacaksa bu tip agaroz uygun olur. Agaroz konsantrasyonu %0,5-1,5 arasında değiştirilerek jelin por çapı ayarlanabilir. Böylece küçük DNA fragmentleri için yüksek büyük DNA fragmentleri için ise düşük agaroz konsantrasyonu kullanılarak DNA’nın jelde en uygun şekilde yürümesi sağlanır. DNA’nın jelde görünür hale gelebilmesi etidyum bromürün DNA bağları arasına bağlanarak 300 veya 360 nm’de ışığı absorblaması sonucu fluerosan etki göstermesi ile olur.
İzole edilen DNA’nın genomik yada plazmid DNA’sı olmasına göre jeldeki görünümleri farklılık gösterir. Genomik DNA keskin bir bant ile bu bandın aşağı yukarı kısmına doğru biraz yayılan bir görüntü verir. Plazmid DNA ise genellikle DNA’nın üç farklı biçimi gözlenir. Plazmid DNA’sına ait süper sarmal biçim (form 1), gevşek sarmal biçim (form 2), ve doğrusal biçim (form 3). Molekül ağırlıkları aynı olmasına karşın bu üç formun jeldeki göçleri farklıdır. Bu farklılık agaroz konsantrasyonuna bağlı olmakla beraber uygulanan akıma, tamponun iyonik kuvvetine ve form 1’in yoğunluğuna da bağlıdır. Optimize olmuş koşullarda genellikle form1 diğerlerine göre daha hızlı hareket eder.
Jele fazla miktarda DNA yüklenmesi sonucunda kenar ve hız etkisi ile jelde yanlış yorumlara yol açabilecek görüntüler ortaya çıkabilir. Örneğin eğer fazla DNA yüklenirse keskin bir bant yerine yaygın bir görünüm meydana gelebilir. Bazen de jelin tamamında elektrik akımının aynı olmaması nedeniyle aynı DNA molekülleri jelin farklı bölgelerinde değişik hızda göç edebilir. Bu durum, düşük voltaj uygulamasıyla bir ölçüde ortadan kaldırılabilir. Ayrıca, örneğin içinde bulunduğu solüsyonun tuz konsantrasyonu da DNA’nın jelde yürümesini etkilemektedir.
Agaroz
Tri-asetat (TAE) tamponu pH 8,0 (50x/litre)
242 g. Trizma-base
57,1 ml. Glasiyel asetik asit
100 ml. 0,5 M EDTA (pH 8,0)
Tris-borat tamponu (TBE), pH 8,0 (5x/litre)
54 g. Trizma base
27,5 g. Borik Asit
20 ml. 0,5 M EDTA pH 8,0
Yükleme Tamponu ( bromophenol blue, BB )
4 M Üre
0,025 M EDTA
%60 Sükroz
%0,025 BB
%0,025 Ksilen
TE Tamponu, pH 8,0
10 mM Tris-HCl pH 8,0
1 mM EDTA pH 8,0
Etidyum bromür (10 mg/ml )
Pulse Field Jel Elektroforezi
Yaklaşık 1 megabazdan daha büyük doğrusal çift iplikli DNA molekülleri agaroz jelde aynı hızda göç ederler. Bunun nedeni jelin por büyüklüğünün doğrusal DNA’nın jelde göç edebilmesi için yeter olmamasıdır. Por büyüklüğü konsantrasyonu % 0,1 olan agaroz kullanılarak arttırılabilir. Fakat bu durumda jel çok kırılgan ve dayanıksız olacağından kullanımı güçleşir. Bu problem 1984’de geliştirilen ve 5 Mb boyutundaki DNA parçalarını da ayırabilen pulse field jel elektroforez tekniği ile ortadan kaldırılmıştır. Bu yöntemle DNA molekülleri belirli zaman aralıklarında birbirlerine farklı açıda iki elektriksel alan etkisinde bırakılır. DNA molekülleri bir elektriksel akıma uygun hareket ederken kısa bir süre sonra diğer akıma uygunluk göstermek zorunda kalırlar.
Sonuçta küçük moleküller elektriksel alan değişimlerine daha çabuk uyum sağladıkları için daha hızlı hareket ederler. Bu yöntemle kromozomları ayrı ayrı görebilmek mümkündür.
Kapiler Elektroforez
Kapiler elektroforez oldukça yeni bir tekniktir ve geliştirme çabaları hala devam etmektedir. Bu tip elektroforez çapı 20-100 mm olan küçük kapiler boru içinde gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajı diğer elektroforetik yöntemlerde oluşan ısının ortadan kaldırılmış olmasıdır. Normal jeller için kullanılan max voltaj 15-40 V/cm iken, kapiler elektroforezde 800 V/cm gibi yüksek bir akım uygulanabilir. Böylece DNA’yı jelde yürütme süresi saatlerden dakikalara düşer ve oldukça önemli bir zaman kazancı sağlanır.
Kapiler elektroforezde DNA’lar lazerle indüklenen fluoresan saptam sistemi ile görüntülenmektedir. Bu teknikle 500-23000 baz çifti arasındaki DNA fragmentleri ayrılabileceği gibi 3-5 Mb arasındaki kromozomların da birbirinden ayrılması mümkün olmaktadır.
DNA’NIN ENZİMATİK KESİMİ
DNA’nın enzimatik kesimi restriksiyon endonükleazları (RE) kullanımı ile yapılır. 1950’li yılların başlarında varlıkları saptanan RE’ler, çift iplikli sarmal DNA’da özel nükleotid dizilerini tanıyan ve DNA’nın her iki ipliğini kesen enzimlerdir. Bakterilerde bulunan bu tip enzimler DNA’da özgün kısa dizileri tanırve kesme işlemini enzime göre değişmek üzere tanıma yerinde veya bu yerin dışında başka özel bir dizide gerçekleştirirler. Kesim sonucunda yapışkan uçlu DNA fragmentleri oluşur.
Aynı DNA dizisini tanıyıp kesebilen farklı RE’ ler de vardır ve bunlara izoşizomer denir.
DNA’NIN RESTRİKSİYON ENDONÜKLEAZLARI İLE KESİLMESİ
20 μl reaksiyon karışımı içerisinde 0,2-1 μg DNA bulunmalıdır. DNA konsantrasyonu fazla ise reaksiyon karışımının hacmi arttırılmalıdır.
Kesim reaksiyonunun durdurulması için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Yöntemin seçiminde örnekle ilgili olarak bir sonraki aşama göz önüne alınmalıdır. Eğer örnek jel elektroforezi ile analiz edilecekse kesim reaksiyonu sadece yükleme tamponu (loadıng buffer) ile durdurulur. Eger örnek Klenow fragmenti veya ligaz etkisinde bırakılacaksa, RE kesinlikle inaktif hale getirilmelidir. RE’lerin çoğu 65 ˚C da, 10-20 dk. tutulduğunda inaktif hale geçer. Reaksiyon durdurucu olarak EDTA da kullanılabilir. Kesimde kullanılan RE, magnezyum iyonunu kofaktör olarak kullanır ve her bir EDTA molekülü iki Mg+2 iyonu bağlar. Ayrıca dietilpirokarbonat(DEPC) eklenerek 65 ˚C’da 10 dakika bekletilmesi sonucu RE inaktif duruma geçer. Yüksek sıcaklıkta DEPC, etanol ve karbondioksite parçalanır. Diğer bir yöntem fenol ekstraksiyonudur, fakat bu yöntemle DNA’nın bir kısmı kaybolabilir.
RE kesimi sonucu elde edilen DNA parçalarının kontrolü, boyutları bilinen standart DNA fragmentleri kullanılarak jel elektroforezi ile yapılmalıdır.
67 views
1.1. Kas Yapısı
İskelet kaslarını oluşturan lifler, TİP I (ST) ve TİP II (FT) şeklinde karışık olarak bulunur ve histolojik-morfolojik yönden iki çeşidi oluşturur. Dolayısıyla bu iki tip lif arasında histokimyasal farklılıklar vardır. Yapılan sporun ve antrenmanın özelliğine göre, aynı tip fibrillerde gelişme olmaktadır (63).
TİP I Lifleri ; yavaş kasılan, oksidatif lifler olup kapiller damarlar yönünden zengin olduğundan, kırmızı lif adını da alırlar. Bu lifler daha çok dayanıklılık faktörü ile ilgilidir. Postürü sağlayan kaslarda bol miktarda bulunur. Anaerobik kapasiteleri düşük, oksidatif kapasiteleri yüksektir. TİP II lifleri ise hızlı kasılan glikolitik liflerdir. Beyaz lif adı da verilir. IIa , IIb ve IIc olmak üzere üç alt gruba ayrılırlar. Tip lla süratli kasılan oksidatif glikolitik, Tip llb süratli kasılan glikolitik, Tip IIc çok süratli kasılan glikolitik fibrillerdir. Bu liflerin en önemli özelliği, hızlı kasılmaları, kasılma sürelerinin kısa, kasılma gücünün ise yüksek olmasıdır. Yüksek şiddette ve daha kısa süreli aktiviteye iyi uyum sağlarlar. Anaerobik kapasiteleri yüksek, oksidatif kapasiteleri düşüktür. Bu nedenle çabuk yorulurlar (63, 3, 65, 48). Hakkinen ve ark (1985) hızlı yapılan çalışmalardaki performansın sinir kas adaptasyonundan oluştuğunu, bunu da genetik faktörlerin belirlediğini tespit etmiştir (55). Bosco ve Komi (1979) performansı etkileyen nedenlerin başında motor ünitelerin mekanik karakteristikleri ve onların kas-fibril yapılarıyla açıklandığını belirtmiştir (18). Ayrıca, ağırlık kaldırmada kabiliyetin artması ise kas grupları arasında koordinenin sağlanmasıyla tespit edilir (87). Ağır direnç ve patlama gücüne yönelik antrenmanların oluşturduğu performans değişikliğinin, insan kaslarının karakteristiklerindeki elektromyografik ve kuvvet, refleks kasılması anındaki değişiklikler özel çalışmaların yol açtığı sinir-kas adaptasyonundan oluşmaktadır (54). Yani, kasın performans ve gelişim derecelerinin de sinir sisteminin olgunlaşmasına bağlı olduğu da unutulmamalıdır (80).
386 views
İklim bütün yaşama yerlerinin üzerini bir örtü gibi kapamış ve doğrudan doğruya ya da dolaylı olarak buradaki canlılara etkisi olmuştur. İklim tek bir etken değil bir etken grubudur (Kansu, 1988). Atmosfer sıcaklığı, basınç, nemlilik ve bunların hepsinin bir aradaki hareketine hava diyoruz. Hava günlere, haftalara, aylara ve yıllara göre değişiklik gösterir ve havanın bu değişikliği böceğin bulunma çokluğunu, ömrünü, gelişme hızını sezondan sezona etkiler. Öte yandan iklim ise birkaç yıllık bir süre zarfında bir bölge üzerinde havanın ortalama durumudur (Romoser & Staffolano, 1994). Hava hızlı bir şekilde değişir ancak iklim çok yıllık periyotla çok yavaş değişir ya da hemen hemen aynı kalır. İncelememiz gereken mikroklima adını verdiğimiz genel olarak bitki örtüsü ile değişen ve atmosferin gayet sıcak tabakalarına ve özel yaşama yerlerine ait olan alandır. Hatta bundan ufak bir diğer iklimde mikro-mikroklima (böcek iklimidir). Bunun yerden itibaren yüksekliği sadece birkaç mm dir (Kansu, 1978).
204 views
1.1. Hayatı Hakkında
1. Avusturya asıllı İngiliz
2. Viyana Üniversitesi’nde matematik, mantık ve fizik okuyor.
3. Yeni Zelanda Canterbury University College’da felsefe dersleri veriyor.(1937 – 1945)
4. İlgiliz yurttaşlığına seçiliyor. (1945)
5. London School of Economics and Political Science’da mantik ve bilimsel yöntem dersleri veriyor. (1949 – 1969)
6. “Sir” ünvanını 1965 yılında alıyor.
7. Açık ve kapalı toplum üzerine yazılarında, Popper’ın, Avusturya gibi nasyonel sosyalizmin tehditi altında bulunan bir toplumdan, İngiltere gibi köklü liberal düşünceleri bulunan bir topluma göç etmesinin çok büyük etkileri vardır.
8. Eserleri:
a. Buluşun Mantığı – 1934
b. Açık Toplum ve Düşmanları – 1945
c. Tarihselciliğin Sefaleti – 1957
d. Nesnel Bilgi: Evrimci Bir Yaklaşım – 1972
48 views
Vücuttaki biyolojik olayların normal olmasına, insan ve hayvanın dengeli gelişmesine sebep olan uzvî (organik) maddelerdir. Vitaminler vücûdun yapı taşı ve enerji verici olmamakla birlikte sağlıklı bir hayat için mutlaka besinler vâsıtasıyle dışardan alınmalıdır. Vitamin kelimesi, sıhhata sebep olan amin mânâsında olup, ilk defâ 1911 senesinde C. Funk adlı bir kimyâcı tarafından kullanıldı. Vitamin isminin kullanılmasından asırlar önce, protein, karbonhidrat, lipid, mâdenler ve su dışında henüz belirlenmemiş bâzı kimyâsal maddelerin de normal beslenme için gerekli olduğu bilinmekteydi. Meselâ, aylarca denizlerde gezen gemiciler limon ve sebze yemediklerinden skorbüt hastalığına yakalanmışlar ve bunun tedâvisinin de limon yemekle mümkün olduğu anlaşılmıştır. Çünkü limonda C vitamini bulunmaktadır. Diğer taraftan, yalnız kabuğu soyulmuş pirinçle beslenen insanlarda beriberi hastalığının meydana geldiği ve bu hastalığın pirinç kabuğu ile tedâvi edildiği bilinmekteydi. Vitamin eksikliğinin sebep olduğu hastalıklara “Avitaminoz” veya “Hipovitaminoz” denir.Bugün ülkemizde, belirli vitamin eksikliklerine seyrek rastlanmaktadır. Böyle eksiklikler görülen kimselerde ya alkolizm gibi çok kötü alışkanlıklar veya sindirim bozukluğu bulunmaktadır. Teknoloji bakımından ileri ülkelerde meydana gelen egoizm (bencillik) ve metaryalizm (maddecilik) hastalığı yaşlanan kimselerin tek başına yaşamasına sebep olmaktadır. Böyle yaşlı kimseler de, tek yönlü hazır yemeklerle beslendiklerinden, vitamin eksikliği görülmektedir. Ayrıca bol miktarda bira ve şarap tüketen bu ülkelerin insanlarında vitamin eksikliğinin olması çok tabiîdir. Çünkü, alkol ince barsaktaki emilimi bozmaktadır. Bu da birçok bakımdan vitamin alamama olayıdır. Bugünkü tıp kat’i olarak alkolün, B2 B6 ve B12 vitaminlerinin alınmasına mâni olduğunu ortaya koymuştur. Bunların eksikliğinin nelere sebep olduğu B2, B6, B12 vitaminleri kısmında geniş olarak anlatılmaktadır.
522 views
Vücudumuzda cereyan eden metabolik olaylara ve her türlü faaliyetimize kaynak teşkil edecek enerji, besinlerle sağlanır. Metabolik hadiselerde gerekli iç ortamı meydana getiren yardımcı rol oynayan mineraller ve vitaminler ile büyümeyi, gelişmeyi ve eskiyen hücrelerin yerine konmasını sağlayacak yapı taşları besinlerle vücuda alınır.
Bugün kanserden damar sertliğine kadar pekçok hastalığın meydana gelmesinde veya ilerlemesinde beslenmenin etkileri anlaşıldığından, yeterli ve dengeli beslenme çok önem kazanmıştır. Besinlerde bulunan gıda unsurları şu gruplara ayrılmaktadır:
1. Karbonhidratlar
2. Yağlar
3. Proteinler
4. Mineraller
5. Vitaminler
6. Su.
Vücutta; 1 gr karbonhidratın yanması 4,1 kalori, 1 gr yağın yanması 9,3 kalori, 1 gr proteinin yanması 4,1 kalori verir. En çok enerjiyi yağların yanması verirse de, asıl enerji kaynağımız karbonhidratlar olup, bunu yağlar takip eder. Vücudun yapı taşlarını meydana getiren proteinler ise ancak ihtiyaç duyulduğunda enerji sağlamak üzere harcanırlar.
33 views
Yaşadığımız yüzyılın özellikle ikinci yarısı yıllarından sonra, bakteri ve virüs genetiği, bunların morfolojik yapıları, kapsadıkları komplike protein, nükleoprotein ve diğer kimyasal bileşimleri, enzimleri saptanmıştır. Enfeksiyon etkenlerinin organizmada üreyip çoğalabilmeleri, patolojik yerleşimlerini oluşturabilmeleri için, gerekli olan yaşam kapsamlarının biri üzerinde etkili olabilecek antimikrobikler üzerindeki araştırmalar da yönünü bulmuş ve üretilen çeşitli antibiyotik ve kimyasal bileşimler, etki mekanizması ve kapsadıkları ana maddeler bakımından gruplara ayrılmıştır.
17 views
Penguins (Order Sphenisformes, Family Spheniscidae) are a distinctive group of flightless birds, which occupy the southern hemisphere. There are generally accepted to be 17 species of penguin. In 1620, Admiral Beaulieu considered penguins to be feathered fish, due to their adaptations to life underwater. They have a streamlined bullet-like shape, and wings that have modified to become flippers. Penguins have an awkward, waddling gait on land, but underwater, they are graceful, and effectively fly underwater using their wings and flexible bodies. Penguins need to preen their feathers regularly with a waxy secretion, to keep them waterproof, and they have a thick layer of blubber, which keeps them warm. Their short, webbed feet are set far back to act as a rudder when in the water. The tuxedo-like coloration of penguins helps to make them less visible when in the water. When viewed from below, their white bellies blend in with the bright sea surface. When viewed from above, their black backs blend in with the dark sea.
12 views
Bütün döllerde kromozom sayısının değişmez kalabilmesi için (sperm ve yumurtanın birleşmesinden kromozom sayısı iki katına çıkacağından dolayı) farklı bir hücre bölünmesi gelişmiştir. Mayoz bölünme ismini alan bu tip bölünmede, kromozom sayısı yarıya indirgenir. Mayoz bölünmenin sonunda meydana gelen gametler diğer vücut hücrelerinin aksine n sayıda kromozom taşır (bazı bitkilerde ve bir hücrelilerde bireyin kendisi yaşantısı boyunca haploid kromozomlu olduğundan mayoz bölünmeye gerek kalmaz). Normal olarak soma hücrelerinde 2n kromozomlardan homolog olanlar, boyuna, sinaps dediğimiz aralıklarla birbirinin yakınında uzanırlar. Bu homolog kromozomların her biri ayrı bir kutba giderek, yalnız bir tanesinin bir gamete verilmesi sağlanır. Homolog kromozomlar ayni büyüklüğe ve sekle, keza benzer kalıtsal faktörlere sahiptir. Gerek yumurta gerekse sperm oluşumu son iki hücre bölünmesine kadar ayni kurallara göre yürütülür. Daha sonra spermatogenezis (sperm oluşumu) ve oogenesiz (yumurta oluşumu) farklı şekilde meydana gelir.
Mayozda da mitoz gibi profaz, metafaz, anafaz ve telofaz diye dört evre vardır. Bu evreler arada interfaz olmaksızın peş peşe iki kez gerçekleşir ve sonuçta dört yavru hücre meydana gelir. Mayoz bölünme ile mitoz bölünme arasındaki en büyük farka profazda rastlanır.
Interfaz
6 views
Organizmada bir takım değişikliklerin ortaya çıkmasıyla fizyoloji görevlerinin bozulması durumuna hastalık denir. Hastalığın mikrop yolu ile yayılan çeşidine ise bulaşıcı hastalık denir.
Bulaşıcı hastalıklar, bulaşma yollarına göre 4 grupta incelenir.
1.Hava Yoluyla Bulaşan Hastalıklar
a-Grip
Grip,virüslerden ileri gelen ve solunum sistemini tutan çok bulaşıcı bir hastalıktır. Ateş, halsizlik, kas ağrıları, soğuk ter,şiddetli öksürük gibi belirtilerle birdenbire başlar.
Grip sırasında bronşit, zatürree, kulak ve göz iltihabı, kalp ve böbrek yetmezliği gibi başka hastalıklar ortaya çıkabilir.
Grip hastalığına yol açan birkaç tip virüs vardır. Bu virüslere H2N2 (Asya gribi), H3N2 (Hong Kong gribi), HSW1N1 (Domuz gribi) gibi kod adları verilmiştir. Bu virüslerden bazılarıyla hazırlanan aşılar deri altına ya da kas içine yapılır ve aşıdan bir hafta kadar sonra hastanın kanında virüse karşı antikorlar oluşmaya başlar.
160 views