&;

DNA’nın izolasyonunda çeşitli yöntemlerden yararlanılır. Genelde izole edilen kromozal plazmid DNA moleküllerinin saflığının kontrolü ve miktarının tayini spektral yöntemlerle yapılmaktadır.

 

SPEKTRAL  YÖNTEMLER

 

Nükleotidlerin heterosiklik halkaları 260 nm. Dalga boyundaki ışığı max. özelliği taşıdığından, dalga boyundaki emme derecesi nükleik asitlerin miktarının ölçüsüdür. göre DNA’nın miktar ve saflığı,spektrofotometrede 260 ve 280 nm. Dalga boylarında elde edilecek değerlerden belirlenebilir. 1 optik dansite () çift iplikli DNA için 50 μg/. tek iplikli DNA veya RNA için 40 μg/. ve oligonükleotidler için ise 20 μg/’ye karşılık gelmektedir.

Örneğin, izole edilen DNA çift iplikli ise,miktarının belirlenmesi için aşağıdaki formülden yararlanılır.

 

DNA(μg/ml) = 260 nm.deki OD x sulandırım oranı x katsayı (50)

 

ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER

 

DNA moleküllerinin analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla beraber tüm laboratuvarlarda rutin olarak yararlanılan en basit yöntemlerden biri jel elektroforezidir. Yöntemin avantajları basit ve hızlı olması, ayrıca diğer yöntemlerle yeterli düzeyde ayrılamayan DNA fragmentlerinin ayrılmasını sağlamaktır.

DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı, molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.

Jel elektroforezinde kullanılan destekleyici madde (matriks) mekaniksel etkiyi engellemek ve molekülleri büyüklüklerine göre ayırmak için kullanılır. Matriks nişasta, poliakrilamid, agaroz veya agaroz akrilamid karışımı olabilir. Poliakrilamid jeller genellikle küçük DNA fragmentleri ve RNA moleküllerinin ayırımında kullanılır. Ancak poliakrilamid jelleri hazırlamak zordur ve uzun süre alır. Ayrıca uygulanacak DNA’nın yüksek konsantrasyonda olması olması gerektiğinden bu tip jellerin kullanılması pratik değildir. Bu nedenle rutin olarak en fazla kullanılan yöntem agaroz jel elektroforezidir.

 

 

                 

                  AGAROZ  JEL ELEKTROFOREZİ

 

Agaroz kırmızı bir alg türü olan Agar agar’dan izole edilen doğrusal bir polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür.

Ticari olarak üretilen agarozların saflık dereceleri farklı olabilmektedir. Bu durum DNA’nın göç hızını etkiler. Ayrıca kimyasal yapısı değiştirilerek düşük sıcaklıkta eriyebilen agaroz tipleride geliştirilmiştir. Bu agarozların ayırım gücü çok fazladır. DNA jelden geri kazanılacaksa bu tip agaroz uygun olur. Agaroz konsantrasyonu %0,5-1,5 arasında değiştirilerek jelin por çapı ayarlanabilir. Böylece küçük DNA fragmentleri için yüksek büyük DNA fragmentleri için ise düşük agaroz konsantrasyonu kullanılarak DNA’nın jelde en uygun şekilde yürümesi sağlanır.  DNA’nın jelde görünür hale gelebilmesi etidyum bromürün DNA bağları arasına bağlanarak 300 veya 360 nm’de ışığı absorblaması sonucu fluerosan etki göstermesi ile olur.

İzole edilen DNA’nın genomik yada plazmid DNA’sı olmasına göre jeldeki görünümleri farklılık gösterir. Genomik DNA keskin bir bant ile bu bandın aşağı yukarı kısmına doğru biraz yayılan bir görüntü verir. Plazmid DNA ise genellikle DNA’nın üç farklı biçimi gözlenir. Plazmid DNA’sına ait süper sarmal biçim (form 1), gevşek sarmal biçim (form 2), ve doğrusal biçim (form 3). Molekül ağırlıkları aynı olmasına karşın bu üç formun jeldeki göçleri farklıdır. Bu farklılık agaroz konsantrasyonuna bağlı olmakla beraber uygulanan akıma, tamponun iyonik kuvvetine ve form 1’in yoğunluğuna da bağlıdır. Optimize olmuş koşullarda genellikle form1 diğerlerine göre daha hızlı hareket eder.

Jele fazla miktarda DNA yüklenmesi sonucunda kenar ve hız etkisi ile jelde yanlış yorumlara yol açabilecek görüntüler ortaya çıkabilir. Örneğin eğer fazla DNA yüklenirse keskin bir bant yerine yaygın bir görünüm meydana gelebilir. Bazen de jelin tamamında elektrik akımının aynı olmaması nedeniyle aynı DNA molekülleri jelin farklı bölgelerinde değişik hızda göç edebilir. Bu durum, düşük voltaj uygulamasıyla bir ölçüde ortadan kaldırılabilir. Ayrıca, örneğin içinde bulunduğu solüsyonun tuz konsantrasyonu da DNA’nın jelde yürümesini etkilemektedir.

 

 

 

GEREKLİ  MALZEMELER

 

Agaroz

 

Tri-asetat (TAE) tamponu pH 8,0 (50x/litre)

                                     242 g.     Trizma-base

                                  57,1 ml.     Glasiyel asetik asit

                                   100 ml.      0,5 M EDTA (pH 8,0)

 

Tris-borat tamponu (TBE),  pH 8,0 (5x/litre)

                                      54 g.      Trizma base

                                   27,5 g.      Borik Asit

                                   20 ml.       0,5 M EDTA pH 8,0

 

Yükleme Tamponu ( bromophenol blue, BB )

                                    4 M          Üre

                             0,025 M          EDTA

                                   %60          Sükroz

                              %0,025          BB

                              %0,025          Ksilen

 

TE  Tamponu, pH  8,0

                                10 mM        Tris-HCl  pH 8,0

                                  1 mM        EDTA  pH  8,0   

 

Etidyum bromür  (10 mg/ml )

 

 

 

Pulse Field  Jel Elektroforezi

 

 Yaklaşık 1 megabazdan daha büyük doğrusal çift iplikli DNA molekülleri agaroz jelde aynı hızda göç ederler. Bunun nedeni jelin por büyüklüğünün doğrusal DNA’nın jelde göç edebilmesi için yeter olmamasıdır. Por büyüklüğü konsantrasyonu % 0,1 olan agaroz kullanılarak arttırılabilir. Fakat bu durumda jel çok kırılgan ve dayanıksız olacağından kullanımı güçleşir. Bu problem 1984’de geliştirilen ve 5 Mb boyutundaki DNA parçalarını da ayırabilen pulse field jel elektroforez tekniği ile ortadan kaldırılmıştır. Bu yöntemle DNA molekülleri belirli zaman aralıklarında birbirlerine farklı açıda iki elektriksel alan etkisinde bırakılır. DNA molekülleri bir elektriksel akıma uygun hareket ederken kısa bir süre sonra diğer akıma uygunluk göstermek zorunda kalırlar.

Sonuçta küçük moleküller elektriksel alan değişimlerine daha çabuk uyum sağladıkları için daha hızlı hareket ederler. Bu yöntemle kromozomları ayrı ayrı görebilmek mümkündür.

 

 

Kapiler Elektroforez

 

Kapiler elektroforez oldukça yeni bir tekniktir ve geliştirme çabaları hala devam etmektedir. Bu tip elektroforez çapı 20-100 mm olan küçük kapiler boru içinde gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajı diğer elektroforetik yöntemlerde oluşan ısının ortadan kaldırılmış olmasıdır. Normal jeller için kullanılan max voltaj 15-40 V/cm iken, kapiler elektroforezde 800 V/cm gibi yüksek bir akım uygulanabilir. Böylece DNA’yı jelde yürütme süresi saatlerden dakikalara düşer ve oldukça önemli bir zaman kazancı sağlanır.

Kapiler elektroforezde DNA’lar lazerle indüklenen fluoresan saptam sistemi ile görüntülenmektedir. Bu teknikle 500-23000 baz çifti arasındaki DNA fragmentleri ayrılabileceği gibi 3-5 Mb arasındaki kromozomların da birbirinden ayrılması mümkün olmaktadır.

 

                  DNA’NIN ENZİMATİK KESİMİ

 

DNA’nın enzimatik kesimi restriksiyon endonükleazları (RE) kullanımı ile yapılır. 1950’li yılların başlarında varlıkları saptanan RE’ler, çift iplikli sarmal DNA’da özel nükleotid dizilerini tanıyan ve DNA’nın her iki ipliğini kesen enzimlerdir. Bakterilerde bulunan bu tip enzimler DNA’da özgün kısa dizileri tanırve kesme işlemini enzime göre değişmek üzere tanıma yerinde veya bu yerin dışında başka özel bir dizide gerçekleştirirler. Kesim sonucunda yapışkan uçlu DNA fragmentleri oluşur.

Aynı DNA dizisini tanıyıp kesebilen farklı RE’ ler de vardır ve bunlara izoşizomer denir.

 

      DNA’NIN RESTRİKSİYON ENDONÜKLEAZLARI İLE KESİLMESİ

 

İzole edilen DNA, RE ile kesime bırakılmadan önce jel elektroforezi ile analiz edilmelidir. Eğer plazmid DNA’sı kesilecekse plazmidin 3 farklı formunun jelde gözlenmesi gerekir.

20 μl reaksiyon karışımı içerisinde 0,2-1 μg DNA bulunmalıdır. DNA konsantrasyonu fazla ise reaksiyon karışımının hacmi arttırılmalıdır.

Kesim reaksiyonunun durdurulması için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Yöntemin seçiminde örnekle ilgili olarak bir sonraki aşama göz önüne alınmalıdır. Eğer örnek jel elektroforezi ile analiz edilecekse kesim reaksiyonu sadece yükleme tamponu (loadıng buffer) ile durdurulur. Eger örnek Klenow fragmenti veya ligaz etkisinde bırakılacaksa, RE kesinlikle inaktif hale getirilmelidir. RE’lerin çoğu 65 ˚C da, 10-20 dk. tutulduğunda inaktif hale geçer. Reaksiyon durdurucu olarak EDTA da kullanılabilir. Kesimde kullanılan RE, magnezyum iyonunu kofaktör olarak kullanır ve her bir EDTA molekülü iki Mg+2  iyonu bağlar. Ayrıca dietilpirokarbonat(DEPC) eklenerek 65 ˚C’da 10 dakika bekletilmesi sonucu RE inaktif duruma geçer. Yüksek sıcaklıkta DEPC, etanol ve karbondioksite parçalanır. Diğer bir yöntem fenol ekstraksiyonudur, fakat bu yöntemle DNA’nın bir kısmı kaybolabilir.

RE kesimi sonucu elde edilen DNA parçalarının kontrolü, boyutları bilinen standart DNA fragmentleri kullanılarak jel elektroforezi ile yapılmalıdır.