Bu çalışmada, infeksiyöz bursal hastalığı ()’nın teşhisinde immunofloresan tekniğinin kullanılması, standardizasyonu ve bu teknikte kullanılacak konjugatın hazırlanması amaçlandı.  İmmunize edilen tavuk ve tavşan immunserumları flourescein isothiocyanate ile işaretlendi. Konjugat standardizasyonu için kontrol ve deneysel infekte gruplardan hazırlanan preparatlarla yapılan testlerde optimal konjugat sulandırmasının 1:16 olduğu belirlendi. Ayrıca standardizasyon çalışmaları sonrasında indirekt FAT’ın relatif olarak direkt FAT’a üstünlüğü saptandı. Saha çalışmalarında, geçiren 27 kümesin 23 (%85.13)’ünde pozitiflik saptandı. Sonuçta, immunofloresan tekniğinin infeksiyonlarında kullanılabilirliği ortaya kondu.

Diagnosis of infection by immunofluorescence

Summary: In this study, evaluation of feasibility and standardization of immunofluorescence technique for identification of infectious bursal disease (IBD) infection, and preparation of the were aimed. Immunized chicken and sera were stained with fluorescein isothiocyanate. In the standardization of the , was determined as 1:16 after the evaluation of smears prepared from the of the control and experimentally infected groups. Indirect fluorescent antibody technique was found to be relatively superior to the direct fluorescent antibody technique after the standardization . In the field studies, 23 out of 28 (85.13%) IBDV infected broiler were detected to be positive by immunofluorescence. As a conclusion, immunofluorescent antibody technique was found to be useful in the identification of the IBD infections.

 

Amaç ve Kapsam

 

IBD Kanatlı sektöründe oldukça önemli ekonomik kayıplara neden olan IBD’nin kısa sürede  kesin teşhisi için immunofloresan tekniğinin () kullanılması amaçlanmıştır.

Akut seyirli IBD, klinik ve nekropsi  bulguları ile teşhis edilebilmesine karşın, aşılı tavuklarda veya subklinik seyirli infeksiyonlarda nekropside makroskopik lezyonlar şekillenmemektedir. Hastalığın kesin teşhisi için virus izolasyonunun yapılması gerekmektedir. İzolasyon yöntemleri, bazı virus suşlarının doku kültürlerine zor adapte olmaları ve embriyolarda ölüm yapmaması nedeniyle zaman alıcı olmaktadır. İzolasyon tekniklerinin bu dezavantajlarını ortadan kaldırmak ve hastalığın kısa sürede kesin teşhisini yapmak için günümüzde en sık kullanılan teknikler arasında IF bulunmaktadır. Bu tekniğin standardizasyonu ile hastalıkla ilgili epidemiyolojik bilgilerin elde edilmesi ve sonuçta hastalığa karşı koruyucu programların oluşturulmasına temel bilgiler sağlaması bakımından projenin gerçekleştirilmesi önemlidir. Ayrıca IBD’nin subklinik formunun IFT ile kolaylıkla belirlenebilmesi ve sonrasında; bu işletmelerde aşılama programlarında yapılacak uygun düzenlemelerle hastalıkta ortaya çıkan kalıcı immunsupresyon ve ağırlık artışında azalmaya bağlı olarak oluşan ekonomik kayıpların azaltılmasıyla önemli kazanç da sağlanacaktır.

 

 

 

 

 

 

III. Materyal ve Yöntem

 

Materyal

 

Deneme hayvanları: Çalışmada 100 adet SPF broiler civciv (Ross 308) kullanıldı. Bu civcivler, IBDV spesifik antikor üretimi, tavuk IgG eldesi  ve deneysel infeksiyon oluşturma amacıyla kullanıldı. Anti-tavuk IgG eldesi için 2 adet New Zeland  ırkı tavşandan yararlanıldı.

Virus: Sahadan izole G41 suşu ile canlı IBD aşı suşu (D78) kullanıldı.

Saha materyali: Anamnez bilgilerine göre Ankara bölgesindeki kümeslerden sağlanan ve Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’na IBD şüphesiyle getirilen piliçler materyal olarak kullanıldı. Bu proje kapsamında 27 kümese ait toplam 224 broiler pilice ait bursa Fabricius incelendi.

Konjugat: İndirekt floresan antikor testinde (IFAT), laboratuvarda hazırlanan konjugatın standardizasyonu için flourescein isothiocyanate (FITC) işaretli tavşan anti-tavuk konjugatı (Sigma F 8888) kullanıldı.

 

            Yöntem

 

Antiserum eldesi: Çalışmada, spesifik IBDV-antiserumu  hazırlamak amacıyla 3 haftalık yaşta 20 adet SPF broiler civciv (Ross 308)  kullanıldı. Bu işlem için, civcivlere D78 aşısı (105 virus/ml,  İntervet) 15 gün ara ile iki kez kasiçi yolla verildi. Son inokulasyon 15 gün sonra hayvanların kanları toplandı ve serumları çıkarıldı. Serum örnekleri immunoglobulin pürifikasyon kolonundan (Econopac, Biorad) geçirildikten sonra FITC ile işaretlenene kadar –20 oC’de saklandı.

İndirekt floresan antikor tekniğinde (IFAT) kullanılacak konjugatın hazırlanması amacıyla, 20 adet civcivin kanları alındı, serumları çıkarıldı ve immunoglobulin pürifikasyon kolonundan (Econopac, Biorad) geçirildikten sonra ayrılan tavuk IgG fraksiyonu, tavşanlara  inkomple Freund adjuvanı ile birlikte (1/1 hacimde) iki hafta ara ile üç kez deri altı olarak inokule edildi. Son inokulasyonu takiben 2 hafta sonra tavşanlardan kan alındı ve serumları çıkarıldı. Bu serumlar FITC ile işaretlenene kadar –20 oC’de saklandı.

Deneysel infeksiyon: Civcivler, 3 haftalık yaşa geldiğinde 20 adetten oluşan üç gruba ayrıldı. Birinci gruptaki civcivler kontrol grubuna ayrıldı. İkinci  gruptaki civcivler D78 aşı suşu üçüncü gruptaki civcivler ise saha suşu (G41)  ile intraoküler yolla infekte edildiler.

 

FITC ile işaretleme: Serum örneklerinin protein içerikleri belirlenmesinden sonra fosfat buffer solusyonu (PBS) ile 20 mg/ml olacak şekilde sulandırıldı. Sulandırılan serum örnekleri ile FITC (30 mg/mg protein) karıştırıldı ve bir gece karanlıkta ve buzdolabında beklendi. Bu solusyon  daha sonra Sephadex G-25 kolonundan geçirildi ve elde edilen konjugat PBS’ye karşı buzdolabında bir gece dializ edildi. Dializ işleminden sonra santrifüj edildi ve süpernatant 1 ml hacimlerde ependorf tüplere ayrılarak kullanılıncaya kadar –20 oC’de saklandı.

IFT konjugatının standardizasyon: Direkt ve indirekt floresan testi için hazırlanan konjugatların standardizasyon çalışmaları, kontrol, aşı suşu (D78) ve saha suşu ile infekte edilen civcivlere ait bursa Fabricius’lardan hazırlanan preparatlarla gerçekleştirildi. Ayrıca hazırlanan tavşan anti-tavuk (indirekt floresan testi)  konjugatının standardizasyonu, ticari tavşan anti-tavuk kanjugatı (Sigma F 8888) ile karşılaştırılarak yapıldı.

Floresan antikor testi: Deneysel infekte, kontrol grubu ve hastalıklı kümeslerdeki piliçlerden alınan bursa Fabricius örneklerinden sürme preparatlar hazırlandı. Preparatlar havada kurutuldu ve kullanılıncaya kadar absolut aseton içinde –20 oC’de saklandı.

İndirekt yöntem : Hazırlanan preparatlar önce PBS ile 3 kez 5 dakika yıkandı. Bu işlemi takiben primer antikor (pozitif serum) ile 30 dakika beklendi. Yıkama işlemini takiben konjugat ilave edilerek 30 dakika inkube edildi. Bu işlemlerin sonunda tekrar yıkama işlemi yapıldı ve preparatlar floresan mikroskobunda incelendi. Sonuçlar, negatif ve boyanan infekte hücre sayısına göre +’dan ++++’ya kadar pozitif olarak değerlendirildi.

Direkt yöntem : Hazırlanan preparatlar önce PBS ile 3 kez 5 dakika yıkandı. Bu işlemi takiben FITC ile işaretli IBDV spesifik konjugat ilave edildi ve 30 dakika inkubasyona bırakıldı. Sonuçlar indirekt yöntemde olduğu gibi değerlendirildi.

 

 

IV.Analiz ve Bulgular

 

            Deneysel infeksiyon bulguları: Deneysel infeksiyon sonrasında saha suşu ile infekte edilen hayvanlarda durgunluk, tüylerde kabarma, beyaz ishal ve iştah kaybı gözlendi.  Deneysel infeksiyonu takiben her üç gruptaki hayvanların tamamına nekropsi yapıldı ve bursa Fabricius’ları preparat hazırlama amacıyla alındı. Nekropside saha suşu ile infekte edilen tüm civcivlerin bursa Fabricius’larının ödemli ve kanamalı olduğu gözlendi. Aşı suşları ile infekte edilen civcivlerin bursa Fabricius’larında ise hafif ödem bulgularına rastlandı.

IFT konjugatlarının standardizasyon bulguları :            Hazırlanan konjugatlar iki katlı olarak sulandırıldı. Her sulandırmadaki konjugatlar, kontrol ve saha suşu ile infekte gruplara ait bursa Fabricius’lardan hazırlanan preparatlarla test edildi. Konjugat standardizasyon çalışmalarından sonra, konjugatların en uygun sulandırmasının 1:16 olduğu saptandı. Bu aşamadan sonra yapılan tüm testlerde konjugat 1:16 olarak sulandırıldı.

Hazırlanan konjugatlar, kontrol gruplarına ait civcivlerin bursa Fabricius’larından hazırlanan preparatlarla reaksiyon vermezken, aşı ve saha suşları ile infekte edilen gruplara ait civcivlerin bursa Fabricius’larından hazırlanan preparatlarla pozitif sonuç verdi. Aşılı grupta reaksiyon ++, +++ olarak belirlenirken saha suşu ile infekte edilenlerde +++, ++++’lık reaksiyon gözlendi. Ticari konjugat kullanılarak gerçekleştirilen testler ile laboratuvarda hazırlanan konjugat ile yapılanlar arasında herhangi bir fark bulunamadı.

Floresan antikor testi bulguları:     Kontrol ve deneysel infeksiyon (D78 ve G41) gruplarına ait civcivlerden hazırlanan preparatlarda gerçekleştirilen direkt ve indirekt IF test bulguları Tablo 1.de sunulmuştur. Testlerde kontrol grubundaki hayvanlara ait preparatlarda reaksiyon gözlenmezken,  aşı ve saha suşu ile deneysel infekte edilen gruplara ait hayvanların tümünde pozitif reaksiyon saptandı. Aşı suşu ile infekte edilen civcivlerde ++ ve +++’lık reaksiyon belirlenirken saha suşu ile infekte edilen gruptaki tüm hayvanlarda ++++’lık bir reaksiyon belirlendi. Ayrıca, IFAT’ta belirlenen reaksiyonun direkt IF’ye göre relatif olarak daha belirgin olduğu saptandı.

 

 

 

 

Tablo 1. Kontrol ve deneysel infekte civcivlere ait materyallerin  direkt ve indirekt floresan antikor test bulguları

 

Gruplar/Testler

Direkt FAT

İndirekt FAT

Konjugat*

Ticari Konjugat

Kontrol

0/20

0/20

0/20

D78

20/20

20/20

20/20

G41

20/20

20/20

20/20

 

* : Laboratuvarda hazırlanan tavşan anti-tavuk konjugatı

 

Direkt ve indirekt floresan antikor tekniği sonuçlarının doğrulanması için AGID testi gerçekleştirildi. AGID testinde kontrol grubuna ait örnekler negatif, aşılı ve saha suşu ile infekte edilen gruplara ait örnekler ise pozitif sonuç verdi. AGID’e göre FAT ve IFAT’ın spesifite ve sensitivitesinin %100 olduğu hesaplandı.

Saha bulguları :        Saha materyalleri, deneysel infeksiyon ve standardizasyon çalışmaları sonrasında  standardize edilen laboratuvarda hazırlanan tavşan anti-tavuk konjugatı ile incelendi. Saha materyallerinin incelenmesinde IFAT kullanıldı.  Materyal alınan kümeslere ait bilgiler ve bulgular Tablo 2. de bildirilmiştir.

Çalışmada klinik olarak IBD infeksiyonu geçirmiş 27 kümesin 23(%85.13)’ünde pozitif reaksiyon saptandı. Negatif sonuç alınan kümeslere ait bursa Fabricius’ların atrofik olduğu ve vakaların görülmesinin üzerinden uzun süre (10-14 gün) geçtiği tespit edildi.

Hastalığın klinik olarak görüldüğü en erken yaş 17 gün olarak belirlendi. Klinik ve nekropsi sonuçları değerlendirildiğinde, hastalığın klinik olarak gözlenmesi sonrasında ilk günlerde (1-4.günler) ishalin yanısıra nekropside bursa Fabricius’larda ödemin görülmesi dikkati çekti. Bu vakalarda IFAT’inde +++ ve ++++’lık reaksiyon belirlendi. Hastalığın ilerdiği dönemde (5.günden sonra), piliçlerin bursa Fabricius’larının atrofik bir durum aldığı gözlendi ve bu materyallerden hazırlanan preparatlarda + ve ++’lık pozitiflik saptandı.

 

V. Sonuç ve öneriler

 

Sonuç olarak, IBD’nin çabuk teşhisinde direkt ve indirekt FAT’nin güvenle kullanılabileceği ortaya konuldu. Bu tekniklerin teşhis laboratuvarlarında kullanılması ile, klinik IBD’nin teşhisi yanısıra özellikle önemli ekonomik kayıplara neden olan ve immunsupresif seyirli subklinik IBD vakalarının saptanmasında avantajlar sağlayacaktır. Bu çalışmada ticari konjugat ile laboratuvarda hazırlanan konjugat ile gerçekleştirilen IFAT arasında herhangi bir fark bulunamadı. Bu sonuç, altyapısı uygun olan laboratuvarlarda hazırlanacak konjugatlarla IBD teşhisinin daha ucuz maliyetle gerçekleştirilebileceğini düşündürdü.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tablo 2. Materyal alınan kümeslere ait bilgiler ve IFAT bulguları

Kümes

Yaş

İnfeksiyon süresi*

İshal

Kaslarda kanama

Bursa Fabricius

IFAT

1 23 4 var Var ödemli +++
2 18 5 var Var ödemli +++
3 34 3 var Var ödemli +++
4 19 3 var Yok ödemli +++
5 37 12 yok Var atrofik
6 27 6 yok Var atrofik +
7 25 3 var Var ödemli +++
8 28 4 var Var ödemli +++
9 34 4 var Var ödemli +++
10 26 6 yok Var atrofik ++
11 17 3 var Var ödemli ++++
12 37 6 yok Var atrofik +
13 21 3 var Var ödemli +++
14 38 13 yok Var atrofik
15 31 4 var Var ödemli +++
16 34 5 var Var ödemli +++
17 28 3 var Var ödemli ++++
18 30 7 yok Var atrofik +
19 41 10 yok Yok atrofik
20 37 14 yok Var atrofik
21 23 6 yok Var atrofik +
22 21 3 var Var ödemli ++++
23 36 5 yok Var atrofik ++
24 37 4 var Var ödemli +++
25 26 6 yok Var atrofik +
26 37 3 var Var ödemli ++++
27 35 5 var Var ödemli +++

 

* : Anamnez bilgilerine göre belirlenmiştir.

 

VI. Kaynaklar

 

1-      Allen, G. M. , McNulty, M. S., Connor, T. J., McCracken, R. M. and McFerran, J. B. (1984): Rapid diagnosis of infectious bursal disease infection by immunoflourescence on clinical material. Avian Pathol. 13: 419-427.

2-      Arda, M., Minbay, A., Aydın, N., Akay, Ö. ve İzgür, M. (1990): Gumboro hastalığı. Kanatlı Hayvan Hastalıkları. Pfizer İlaçları s. 147-140.

3-      Cho, B. R., Synder, D. B., Lana, D. P. and Marpuardt, W. W. (1987): An immunoperoxidase monoclonal antibody stain for rapid diagnosis of infectious bursal disease. Avian Dis. 31: 538-545.

4-      Cruz-Coy, J. S., Giambrone, J. J. and Panangala, V. S. (1993): Production and characterization of monoclonal antibodies against variant  A infectious bursal disease virus. Avian Dis. 37: 406-411.

5-      Goldman, M. Carver, R. K. (1957): Preserving flourescein isocyanate for simplified preparation of fluorescent antibody. Science. 126: 839-840.

6-      Goldman, M. (1968): Fluorescent antibody methods. Biogenetics Research. USA. Academic Prees. 11-28.

7-      Harlow, E. Lane, D. (1988): Labelline antibodies with fluorochromes antibodies. A Laboratory  Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harborn Laboratory. 353-358.

8-      Henderson, K. S. and Jackwood D. J. (1990): Comparison of the dot blot hybridization assaywith antigen detection assays for the diagnosis of ınfectious bursal disease virus infections. Avian Dis. 34: 744-748.

9-      Jeffrey, I. S. (1982): Fluorescencemicroscopy. International Laboratory . 12 : 46-52.

10-  Jensenius, C., Andersen, I., Hau, J., Crone, M. and Koch, C. (1981): Eggs: Conveniently packaged antibodies. Methods for furification of yolk IgG. J. Immunol. Meth. 46: 63-68.

11-  Johnson, G. D. Dollhope, F. L. (1968): Filter systems for flurescent antibody techniques. Immunology. 15: 619-621.

12-  Kumar, A. and Rao, A. T. (1993): Immunofluorescent studies on infectious bursal disease in chickens. Indian Vet. J. 15: 26-29.

13-  Lukert, P. D. and Saif, Y. M. (1991): Infectious bursal disease. In: Disease of poultry, 9th edition. Calnek B. W. Iowa State University Press. Ames, Iowa. USA. 648-668.

14-  Maestrone, G. and Coffin, D. L. (1964): Study of Newcastle disease by means of fluorescent antibody technique.  Am. J. Vet.Res., 25:217-223.

15-  Office International des Epizooties. (1996): Infectious bursal disease (Gumboro disease), Chapter 3. 6. 1. In: Manual of standarts for diagnostic tests and vaccines. Lists A and B diseases of mammals, birds and bees. 3th edition. Paris.

16-  Porath, J. and Flodin, P. (1960): Gel filtration: A method for desalting and gruop separation. Nature. 183: 1657-1659.

17-  Rosales, G. A., Villegas, P., Lukerd, D., Fletcher, J. O. and Brown, J. (1989): Immunosupressive potential and pathogenecity of a recent isolate of infectious bursal disease virus in commercial broiler chickens. Avian Dis. 33: 724-728.

 

 

VII. Ekler

 

  1. a.      Projenin toplam bütçesi 3.760.000.000 TL dir. Bu bütçenin 3.560.000.000 Tüketim Mal ve Malzemeleri (400) kaleminden olup 200.000.000 TL’si yolluklar (200) kaleminden sağlanmıştır. Ancak 200 kalemideki harcamalar, Araştırma Fon Müdürlüğü izni ile 400 kalemine aktarılmıştır. Bütçenin 400 kaleminden 3.678.370.000 TL harcama yapılmıştır. Kalan miktar ise 81.630.000 TL. dir.
  2. b.      Makine ve teçhizat alımı yapılmamıştır.
  3. c.       Yok
  4. d.      Yok
  5. e.       Proje kesin rapornundan sonra hakemli bilimsel bir dergide yayın haline getirilecektir.