Başta pemfigus olmak üzere otoimmün büllöz hastalıkların önemli bir kısmının tedavisinde, yan etki veya komplikasyon geliştirme riskleri oldukça yüksek ilaçlar veya yöntemler kullanılmaktadır. Dolaysıyla uygun ve etkin bir tedavi için kesin tanı şarttır. Bazen gerçek tanı klinik ön tanılardan hiç birisi olmayabilir ve kesin tanıya ancak bir laboratuar yöntemi ile ulaşılabilir. Hatta bazı büllöz hastalıkların tanısını koyabilmek için böyle bir laboratuar yönteminin kullanılması zorunludur. Örneğin lineer IgA dermatozunda zaten hastalığa adını veren de immünopatolojik bir yöntemle tespit edilen immünoglobulinin tipi ve depolanma paternidir. Sanırım hiçbir deri hastalığı otoimmün büllöz hastalıklar kadar başarılı sonuçlarla araştırılmamıştır. Bunun sonucu olarak tanıda kullanılabilecek çok sayıda ve oldukça etkili laboratuar yöntemleri geliştirilmiştir. Klasik histolojik yöntemlere ilave olarak 1960’lı yıllardan itibaren gündeme gelen immünofloresan yöntemler, 1970’li yılların sonundan itibaren kullanıma giren immünoenzimatik yöntemler ve 1990’lı yıllardan itibaren başarılı bir şekilde kullanılan immünoblotting bu hastalıkların tanısında oldukça etkili yöntemlerdir (Tablo I).

Bu yazıda; otoimmün büllöz hastalıkların tanısında kullanılan bazı laboratuar yöntemlerinin kısaca uygulama tekniklerinden ve söz konusu hastalıklarda bu yöntemlerle elde edilen bulgulardan bahsedilmiştir.

Tablo I. Otoimmün büllöz dermatozlarda tanı yöntemleri.

  1.       I.        Klinik özellikler
  2.     II.        Bül sıvısından sitolojik tetkik ()
  3.    III.        Histopatoloji
  4.    IV.        İmmünofloresan (İF) teknikler
  5.      V.        İmmünoenzimatik teknikler
  6.    VI.        İmmünoblotting, immünopresipitasyon, ELİSA
  7.   VII.        Elektronmikroskopi, immünoelektron mikroskopi

Sitolojik Tetkik (Tzanck smear): Pemfigus tanısında kullanılan ancak histolojinin yerini alamayan bir ön tanı testidir. Hızlı, kolay ve oldukça duyarlı bir yöntemdir. İntakt bül-vezikül sıvısından veya erozyon-ülser tabanından alınan kazıntı materyalinden hazırlanan yaymalar Giemsa ile boyanır. Mikroskopik incelemede akantolitik keratinositlerin (yuvarlak, nükleus-sitoplazma oranı normal keatinositlere göre azalmış, perinükleer halonun olduğu, hiperkromatik nükleuslu hücreler) görülmesi pemfigusa işaret eden (%90 pozitif) bir bulgudur. Multinükleer dev keratinositlerin varlığı ise herpetik enfeksiyonların işareti olup bu anlamda klinik ayırıcı tanıda da yararlı bir testtir.

İmmünofloresan (İF) Teknikler: Fluorescein ile işaretlenmiş anti-human antikorlar aracılığı ile otoantikorların serum ve deri örneklerinde tespitine yönelik bir immünopatolojik testtir. Otoimmün büllöz hastalıkların rutin tanısında kullanılan en önemli test olup tek başına tanıyı koydurabilir. Mevcut tanıyı kesinleştirebilir, modifiye edebilir veya klinik tanıdan tamamen farklı bir tanının konmasını sağlayabilir. İF teknikler sayesinde yeni antiteler de (büllöz SLE, lineer IgA dermatozu, IgA pemfigusu gibi) tanımlanmıştır. Temel olarak direkt immünofloresan (DİF) ve indirekt immünofloresan (İİF) şeklinde iki yöntem söz konusudur. DİF deri örneklerinde depolanmış antikorların varlığını, İFF ise serumda dolanan antikorların varlığını ortaya koyar. DİF’de frozen kesitleri yapılmış doku örnekleri doğrudan fluorescein konjugat ile enkübe edilirken, İFF’de seri dilüsyonları yapılmış serum örnekleri önce bir substrat ile (maymun özefagusu, normal insan derisi veya sıçan özefagusu gibi) ardından da fluorescein konjugat ile enkübe edilir. Hazırlanan preparatlar uv mikroskopu ile incelenir.

İmmünoenzimatik Teknikler: DİF’deki temele dayanmakla birlikte farklı olarak enzim (genellikle horseradish peroksidaz) işaretli antikorlar kullanılır. Çok sayıda yöntem söz konusudur. Ancak en sık peroksidaz-anti-peroksidaz (PAP) ve avidin-biotin complex (ABC) teknikler kullanılır. İF yöntemlere göre birtakım avantajlara sahip olmakla birlikte otoimmün büllöz hastalıkların tanısında asli tanı yöntemi olarak İF yöntemlerin yerini alamamıştır. Bugün için genellikle iyi diferansiye olmamış kutanöz tümörlerin ve lenfomaların tanısında daha geniş kullanım alanları bulmaktadır.

İmmünoblotting (Western-blot): Amaç oto-antikorların hedef aldığı hücre-hücre ve epidermis-dermis adezyonlarında rol alan antijenik molekülleri saptamaktır. Bunun için önce epidermal veya dermal ekstraktlar jel içerisinde elektoforetik separasyondan geçirilir ardından da ayrılan proteinler bir membrana aktarılır. Oluşan protein bantları ilgili proteinlere karşı gelişmiş antikorlarla enkübe edilir ve meydana gelen antikor-antijen reaksiyonu radyoaktivite veya boyama işlemi ile görünür hale getirilir. Bugün için otoimmün büllöz hastalıkların kesin tanısında kullanılan en etkili yöntemlerden birisidir.

Tanı Araştırmalarında Kullanılacak Örneklerin Elde Edilmesinde Genel İlkeler: Otoimmün büllöz hastalıklara tanısal yaklaşımda en uygun olanı hastadan 3 örneğin birlikte alınmasıdır;

I.Örnek (Histopatolojik inceleme için deri veya mukoza örneği): Örnek mutlaka 48 saatten yaşlı olmayan erken bir bülden, kenarından normal deriyi de kapsayacak şekilde cerrahi biyopsi şeklinde (punch tercih edilmez) alınmalıdır. Mukozal ülser veya erozyonlarda ise kenardaki inflame alandan alınmalıdır.

II.Örnek (DİF için deri veya mukoza örneği): Yine taze bir bülün kenarından ancak bu sefer normal görünümlü deriden alınmalıdır. Mukozal ülser veya erozyonda ise normal görünümlü perilezyonel mukozadan alınmalıdır.

III.Örnek (İFF için serum örneği): 5 ml serum veya pıhtılaşmış kan.